百合( Lilium) 集觀賞、藥用、食用價(jià)值于一身，是農(nóng)業(yè)栽培中重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái)，隨著全球百合種球貿(mào)易的擴(kuò)大，我國(guó)百合進(jìn)口、引種數(shù)量和種植面積的不斷增加，加之不規(guī)范的種植和種球自繁，病毒病開(kāi)始在各百合種植區(qū)迅速流行。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)百合病毒的發(fā)病率一般在40% ～ 50%，二代種球的帶毒率在90%以上，病毒病已成為加速我國(guó)百合種群衰退的重要因素之一。目前已報(bào)道的百合病毒約有20 余種，還有植原體( Phytoplasma) 一種，其中以百合無(wú)癥病毒( Lily symptomlessvirus，LSV) 、黃瓜花葉病毒( Cucumber mosaic virus，CMV) 和百合斑駁病毒( Lily mottle virus，LMoV) 等最為嚴(yán)重，其他各種病毒均為局部地區(qū)發(fā)生。百合病毒常復(fù)合侵染，主要對(duì)百合的葉片和鱗莖構(gòu)成傷害，從而影響百合植株大小和產(chǎn)量，進(jìn)而影響花枝長(zhǎng)度、花色，降低品質(zhì)。不同病毒在百合上表現(xiàn)相似癥狀，同種病毒在不同條件下的癥狀有很大變異，給病害的田間診斷和防治帶來(lái)極大困難。當(dāng)前我國(guó)百合切花用種球主要來(lái)源于荷蘭進(jìn)口和國(guó)內(nèi)自繁，為防止百合病毒病隨種球擴(kuò)散與傳播，就必須加強(qiáng)百合檢疫和檢測(cè)，而這有賴(lài)于建立靈敏、快速和可靠的病毒檢測(cè)方法。近年來(lái)，百合病毒檢測(cè)的研究已取得了一定的進(jìn)展，主要方法有植物指示法、電子顯微技術(shù)、血清學(xué)方法及分子生物學(xué)檢測(cè)法。
1 指示植物法
指示植物鑒定是最基本的百合病毒檢測(cè)方法。通常采用汁液接種法將百合的汁液接種到指示植物上，然后根據(jù)指示植物的感病表現(xiàn)來(lái)研究百合是否帶毒及病毒的生物屬性和種類(lèi)。根據(jù)病毒的不同，用于百合病毒檢測(cè)的常見(jiàn)指示植物有心煙葉、番茄、昆諾藜、百日草、郁金香、千日紅等。指示植物法雖然簡(jiǎn)單，但檢測(cè)速度很慢，癥狀表現(xiàn)的時(shí)間最短需要10 ～ 20 d，長(zhǎng)則需要30 ～ 90 d，且靈敏度較低，受季節(jié)限制嚴(yán)重，此外，指示植物園的維護(hù)費(fèi)用也較高。Masuta 和Ryu 等研究發(fā)現(xiàn)侵染百合的植物病毒寄主范圍很窄，毒原的繁殖幾乎只能在百合上進(jìn)行，通過(guò)傳統(tǒng)生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定很難，病毒長(zhǎng)期侵染百合，會(huì)發(fā)生寄主適應(yīng)性變異，導(dǎo)致其寄主范圍變窄，很難利用指示植物發(fā)進(jìn)行檢測(cè)，而有些只能由蚜蟲(chóng)傳播的百合病毒不適合此種方法。因此，指示植物法應(yīng)用的局限性較大。
2 電子顯微技術(shù)
電子顯微技術(shù)( Electron microscope，EM) 的主要方法包括負(fù)染色法、超薄切片法、免疫電鏡技術(shù)和膠體金免疫電鏡等。目前，主要應(yīng)用于百合病毒檢測(cè)的是免疫電鏡法。免疫電鏡( Immunoelectron microscopy，ISEM) 是應(yīng)用特異性抗血清與相應(yīng)病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)，經(jīng)負(fù)染后于電鏡下觀察病毒粒子的一種方法。具有高的靈敏性和直觀性，可以準(zhǔn)確地確定病毒的種類(lèi)。現(xiàn)在歐洲已將ISEM作為百合種球LSV、LVX 等病毒推薦檢測(cè)方法之一，在檢__疫及百合生產(chǎn)中廣泛采用。免疫電鏡技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了電鏡技術(shù)在百合病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，但由于電子顯微鏡的造價(jià)較高，樣品的制備繁瑣、費(fèi)用昂貴，所以應(yīng)用受到了一定的限制。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)一種膠體金免疫電鏡技術(shù)，此法是先將樣品與特異免疫球蛋白反應(yīng)，再用蛋白A-膠體金標(biāo)記，經(jīng)負(fù)染后用電鏡進(jìn)行觀察，由于膠體金的附著，在電鏡下很容易檢測(cè)出病毒粒子的存在，檢測(cè)效果比免疫電鏡法更佳，可用于快速檢測(cè)和鑒定病汁液中線(xiàn)狀病毒、棒狀病毒以及球狀病毒，大幅度提高同抗血清對(duì)病毒的捕獲能力。膠體金制備容易，價(jià)格低廉，不僅可用于常規(guī)光鏡，而且還可用于熒光顯微鏡，應(yīng)用于快速檢測(cè)技術(shù)還具有操作簡(jiǎn)單快速，特異性、敏感性好，可單份測(cè)定，結(jié)果直觀，且可保存試驗(yàn)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。
3 血清學(xué)方法
血清學(xué)方法以其快速、準(zhǔn)確、適于批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，已成當(dāng)前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)百合病毒的常用技術(shù)。血清學(xué)是利用抗原抗體的免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)植物是否帶病毒。檢測(cè)百合病毒的血清測(cè)定方法主要有: 酶聯(lián)免疫( ( EnzymelinkedImmunoassay，ELISA ) 、圓點(diǎn)免疫結(jié)合法( Dot-ELISA，DBIA) 和組織印跡法( Tissue Blot-ELISA，TBIA) 。ELISA 是目前百合病毒檢測(cè)最常用的一種檢測(cè)方法，大部分侵染百合的病毒都可由此種方法檢出。荷蘭Asjes用ELISA 對(duì)周年循環(huán)中初侵染和再侵染植物的百合無(wú)癥病毒( LSV) 和百合斑駁病毒( LMoV) 的毒源率和病毒量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。梁巧蘭等利用ELISA 檢測(cè)侵染觀賞百合黃瓜花葉病毒的研究。劉成科等建立了百合無(wú)癥病毒單克隆抗體制備及快速檢測(cè)方法。現(xiàn)已商品化的ELISA 試劑盒有很多，如美國(guó)Agdia 公司的南芥菜花葉病毒( ArMV) 、煙草環(huán)斑病毒( TRSV) 、郁金香碎錦病毒(TBV) 、黃瓜花葉病毒( CMV) 、百合無(wú)癥病毒( LSV) 等ELISA 試劑盒。圓點(diǎn)免疫結(jié)合法( DBIA) 用硝酸纖維素膜代替酶標(biāo)板，使檢測(cè)更為簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)。而組織印跡法( TBIA)在前者基礎(chǔ)上，直接把感病組織切塊固定硝酸纖維膜上，然后利用抗原抗體特異反應(yīng)來(lái)檢測(cè)植物病毒。研究證實(shí)，TBIA 更靈敏，比DBIA 和ELISA 有更高的病毒檢出率。而DIAB 在百合病毒檢測(cè)上最主要的應(yīng)用就是檢測(cè)病毒在百合植株中的空間分布，在百合種球規(guī)模化病毒檢測(cè)方面具有良好的前景，目前廣泛地應(yīng)用于百合病毒CMV、LSV、LMoV 的檢測(cè)與調(diào)查，檢測(cè)CMV 的靈敏度可達(dá)1． 2 g /ml，可檢測(cè)出低濃度病毒的存在。
4 分子生物學(xué)法
分子生物學(xué)技術(shù)是通過(guò)檢測(cè)病毒核酸來(lái)證實(shí)病毒的存在的一種方法。常用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括核酸分子雜交技術(shù)、雙鏈RNA 電泳技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR( RTPCR)技術(shù)。目前常用的方法是RT-PCR 技術(shù)，其突出的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、靈敏度高，將病毒檢測(cè)靈敏度由血清學(xué)的ng 水平提高到了pg 級(jí)。可用于大量樣品的檢測(cè)，并且適應(yīng)范圍廣，應(yīng)用對(duì)象可以是RNA 病毒、DNA 病毒和類(lèi)病毒。Hagita 等設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR 方法從染病百合中成功檢測(cè)出百合X 病毒( LXV) 。劉毅等從進(jìn)境百合中檢出了南芥菜花葉病毒( ArMV) 。于翠等從進(jìn)境百合中檢出了草莓潛隱環(huán)斑病毒( SLRSV) 。韓麗娟等進(jìn)行了侵染百合的李屬壞死環(huán)斑病毒病( PNRSV) 的研究。RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)百合病毒無(wú)放射性危險(xiǎn)，可以檢測(cè)到pg 數(shù)量級(jí)的植物病毒及同時(shí)檢測(cè)大規(guī)模的樣品。而近年來(lái)，在RT-PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)一種多重RTPCR( muhiplex PCR) ，是在普通PCR 的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在同一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)DNA 模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR 技術(shù)。由于多重PCR 同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，特別是節(jié)省珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品，所以一經(jīng)提出，即得到眾多研究者的青睞，并且發(fā)展迅速，在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域成為一項(xiàng)重要的研究手段。應(yīng)用此法，徐榕雪等從東方百合雜種系“索蚌”( Oriental hybrids‘Sorbonne’) 中同時(shí)檢出了黃瓜花葉病毒( CMV) 、百合斑駁病毒( LMoV) 和百合無(wú)癥病毒( LSV) 。黎昊雁等以復(fù)合RT-PCR 方法同步檢測(cè)百合X 病毒、百合無(wú)癥病毒及百合斑駁病毒。利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)百合病毒的研究很多，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新技術(shù)不斷推出，原有技術(shù)也在不斷改進(jìn)，近年來(lái)發(fā)展的基因芯片技術(shù)將無(wú)數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸、cDNA、基因組( Genomic) DNA 在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣品中同源核酸分子雜交，對(duì)樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析，可大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息，在百合病毒檢測(cè)上的發(fā)展前景廣闊。