2 酶聯(lián)免疫技術安全檢測中的應用
2. 1 動物傳染病的診斷 豬偽狂犬病( Pseudo rabies, PR) 是由偽狂犬病病毒( Pseudo rabies Virus,PRV) 引起的以發(fā)熱和腦脊髓炎為主要特征的急性、熱性傳染病。一般幼齡仔豬發(fā)病率和死亡率可高達100% , PR 的傳播和蔓延, 給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失, 全世界每年因PR 造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元 。Af shar、Bush 等分別建立了檢測PRV 抗體的間接ELISA 方法 。T jeerd G Kimman 等用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了PRV 糖蛋白 14 鄭州牧業(yè)工程高等專科學校學報第30 卷gE 并構建了間接ELISA。表達所用的gE 基因片段是gE 的主要抗原位點而不是跨膜區(qū), 該基因被克隆在PRV gG 標記序列和桿狀病毒表達載體的p10 啟動子后, 被高效表達。與其他的商用試劑盒一起對感染過PRV 的一系列血清作檢測, 結果表明, 所建立的間接ELISA 具有高度的特異性和中等程度的敏感性 。邱德新等用辣根過氧化物酶( HRP) 標記純化的兔抗豬IgG 制備出高效價的酶標抗體, 工作濃度為1 50000; 經(jīng)各種條件的篩選,建立了檢測豬PR 血清抗體的間接ELISA。與豬支原體、豬瘟、O 型口蹄疫、豬細小病毒標準陽性血清呈陰性反應, 與臨床未感染PRV 的豬血清和豬PR標準陰性血清呈陰性反應; 與臨床發(fā)病豬血清、豬免疫豬血清和PR 標準陽性血清呈明顯的陽性反應。豬瘟( Classical Sw ine Fever, CSF) 又稱豬霍亂( Ho g Cholera, HC) , 是由豬瘟病毒引起的豬的一種急熱性致死性疾病。豬瘟具有高度接觸傳染性,流行廣泛, 發(fā)病率高、死亡率高, 危害極大。近幾年主要表現(xiàn)在從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)律的散發(fā)性流行; 疫點顯著減少, 臨床癥狀從典型變?yōu)榉堑湫?病原毒力降低, 病程由急性、亞急性轉(zhuǎn)變?yōu)槁詾橹? 出現(xiàn)持續(xù)性感染、胎盤感染、母豬繁殖障礙以及新生仔豬的先天性感染。余興龍等以在大腸桿菌高效表達的豬瘟病毒E2 基因主要抗原編碼區(qū)( mE2)為抗原, 以辣根過氧化物酶( HRP) 標記的兔抗豬IgG 為二抗, 建立了檢測豬瘟病毒抗體的間接ELISA 方法。經(jīng)檢測篩選出最佳反應條件為: 12g/ 孔純化的表達大腸桿菌的mE2 重組蛋白包被酶標板, 用10 %的兔血清或馬血清進行封閉, 以正常大腸桿菌裂解上清液稀釋待檢血清。試驗表明應用重組mE2 蛋白作為診斷豬瘟的抗原, 具有特異性高、易純化和成本低等特點 。
2. 2 藥物殘留的檢測 畜產(chǎn)品中藥物的殘留是指在養(yǎng)殖過程中, 為防病治病而人為添加的、在生物體內(nèi)產(chǎn)生積累或代謝不完全的藥物。違禁用藥或藥殘超過安全限量的畜產(chǎn)品, 攝食后將直接危害人體健康。現(xiàn)在國際上比較重視的殘留藥物有抗生素、激素類、磺胺類、呋喃類、喹諾酮類等。在抗生素殘留的檢測中, 目前最常用的是微生物抑制分析方法、高效液相色譜( HPLC) 、氣相色譜( GC) 、氣質(zhì)聯(lián)用( GC - MS) 等, 但這些方法有它們的局限性。微生物法缺乏靈敏度和特異性; HPLC、GC 檢測則樣品的前處理耗費大量的時間, 并且需要昂貴的實驗室設備。使用ELISA 法樣品前處理簡便, 同時可分析多個樣品, 分析時間短, 且敏感度高, 特別適于做日常大量樣品的篩選工作, 同時也減少HPLC、GC 方法較高的成本并避免造成環(huán)境污染。豬肉組織中藥物殘留檢測已有報道。2000 年,Ko E 等研究直接競爭性酶聯(lián)免疫吸附檢測豬肉中的磺胺二甲基嘧啶( SMz) 。抗體經(jīng)親和層析凈化后包被微量滴定板。在豬肉組織中加人磺胺二甲基嘧啶, 用二氯甲烷提取。提取的SMz 用自建ELISA方法、ELISA 試劑盒、高效液相色譜( HPLc) 測定,結果較為理想。抗體包被的酶聯(lián)反應板置40 溫度放置14 d 均未發(fā)現(xiàn)靈敏度變化。此試驗自建的ELISA 方法在豬肉組織中SMz 檢測限量為10 ng/g , 這種方法可以應用在畜產(chǎn)品sMz 檢測中 。乳類食品檢測藥物殘留已經(jīng)發(fā)展了很多種, 目前研究方向已向著多殘留檢測發(fā)展。2003 年,Loomans KE 等建立ELISA 方法同時檢測牛奶中的慶大霉索、卡那霉素和新霉索。研究者首先用一種抗體建立ELISA 方法同時檢測牛奶中的慶大霉素、卡那霉素和新霉素三種藥物殘留。用新霉胺半抗原通過EDC( 碳化二亞胺法) 偶連藍白蛋白大分子作為免疫原免疫家兔產(chǎn)生的多克隆抗體建立ELISA 方法 。
2. 3 生物毒素的檢測 畜產(chǎn)品中常常涉及的生物毒素是真菌毒素。其中主要是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素( AFT) 是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一組次生代謝物, 其中黃曲霉素B1( AFB1) 毒性最大, 分布也最廣, 已正式被定為人類的致癌物質(zhì), 是飼料中的典型毒素之一。早在1998 年, 我國就確定了飼料中AFB1 的ELISA 檢測方法的國家標準。近十幾年來, 用于生物毒素檢測的ELISA 方法得到迅速發(fā)展, 已有多種可靠的ELISA 診斷試劑盒用于分析不同的毒素 。與HPLC 和LC - MS 的廣泛比較,證明ELISA 同樣具有較高可信度。陳蘭明等采用辣根過氧化物酶( HRP) 標記高親和力的黃曲霉毒素B1 抗體, 建立了標記抗體型直接競爭抑制ELISA 快速篩選法。該法檢測A FB1 的線性范圍為0. 25~ 5. 0 ng/ mL, 靈敏度為12. 5 pg 。